PCR (cercetare) - aplicație. Ce este tehnica PCR?

PCR este un test care a fost utilizat în diagnosticul multor boli. Metoda PCR permite arătarea prezenței directe a bacteriilor în organism și, în special, a ADN-ului acestuia. Testarea PCR este utilizată, printre altele în diagnosticul bolii Lyme. Ce este tehnica PCR? Ce este PCR în timp real?

Cuprins:

1. PCR (testare) - care este tehnica PCR?
2. PCR (cercetare) - aplicarea metodei PCR
3. PCR (cercetare) - boala Lyme
4. PCR (cercetare) - rezultate. Pot fi fals pozitivi?
5. PCR (cercetare) - rezultate. Pot fi fals negative

PCR (reacția în lanț a polimerazei) este metoda de bază utilizată în laboratoarele genetice și moleculare. A fost dezvoltat în 1983 de Kara Mullis, care a primit Premiul Nobel în 1993 pentru aceasta.

Ascultați despre ce este vorba despre tehnica de testare PCR. Acesta este material din ciclul BINE ASCULTARE. Podcast-uri cu sfaturi.

Pentru a vizualiza acest videoclip, activați JavaScript și luați în considerare actualizarea la un browser web care acceptă videoclipuri HTML5

PCR (testare) - care este tehnica PCR?

Testarea PCR constă din amplificare multiplă (de obicei în 30-40 de cicluri) a unui fragment de ADN specific, de exemplu gene care codifică proteinele Borrelia, cu utilizarea enzimei polimerazei.

Apoi, se folosesc coloranți moleculari speciali pentru a face vizibil fragmentul de ADN amplificat. PCR, datorită amplificării fragmentelor specifice de ADN, este o metodă ultra-sensibilă.

În metoda PCR, fragmentele de ADN sunt amplificate folosind perechi de primer specifice pentru o regiune dată a ADN-ului bacterian. De exemplu, regiunile țintă din PCR utilizate în diagnosticul bolii Lyme sunt gene care codifică proteinele, de ex. 16S rADN, recA, fla, p66, OspA.

Materialul biologic din care se poate efectua testul este:

• sânge
• o secțiune de piele dintr-un eritem migrator
• fluid cerebrospinal
• lichid sinovial sau din cartilajul articular
• urină

PCR (cercetare) - aplicarea metodei PCR

În plus față de diagnosticul borreliozei Lyme utilizând metoda PCR, este posibil să se detecteze fragmente de ADN specifice ale altor microorganisme sau oameni. Prin urmare, metoda PCR este utilizată și în:

• diagnosticarea și monitorizarea infecțiilor virale: virusuri herpetice (herpes, herpes zoster, Epstein-Barr, citomegalovirus), HIV, virusuri hepatitice (VHB și VHC)
• diagnosticarea și monitorizarea infecțiilor bacteriene, în special a acelor bacterii care nu pot fi identificate prin culturi, de exemplu tuberculoza
• diagnosticarea și monitorizarea bolilor neoplazice: leucemie, cancer de sân, cancer colorectal, cancer pulmonar
• diagnosticul predispoziției cancerului: cancer de sân și ovarian (gene BRCA1 și BRCA2), cancer colorectal (gene APC și CHEK2)
• diagnosticarea bolilor genetice: hemocromatoza (gena HFE), talasemia (genele HBA1 și HBA2), boala celiacă (genele HLA)
• teste de paternitate, care detectează compatibilitatea ADN a copilului și a tatălui

Citește și: Testele bolii Lyme - cum arată și care este prețul testelor bolii Lyme Testul Western Blot și boala Lyme. Interpretarea rezultatelor testului Boli transmise de căpușe: boala Lyme, babezioză, bartoneloză, TBE și altele.

În prezent, există multe modificări ale metodei PCR. De exemplu, în diagnosticul borreliozei Lyme, sunt utilizate în principal metodele PCR imbricate (PCR imbricate) și PCR în timp real. Aceasta din urmă este o metodă cantitativă și permite determinarea numărului exact de copii ADN Borrelia în materialul biologic testat.

PCR (cercetare) și boala Lyme

Testele serologice stau la baza diagnosticului bolii Lyme. Cu toate acestea, există situații clinice care pot face ca aceste teste să fie fals negative:

• fereastra serologică, adică perioada inițială de infecție în care organismul nu produce încă anticorpi specifici IgM și IgG împotriva spirochetelor Borrelia
• la persoanele cu imunodeficiență care nu produc suficienți anticorpi
• prezența complexelor imune care constau din antigeni Borrelia și anticorpi specifici pentru aceștia și previn detectarea anticorpilor prin metode serologice

Dacă simptomele bolii Lyme sunt suspectate la pacient și rezultatele testelor serologice sunt negative, se pot efectua teste moleculare bazate pe metoda PCR.

ADN-ul spirochetelor Borrelia poate fi detectat în stadiul incipient al infecției, deoarece numărul de spirochete din fluidele corporale este atunci cel mai mare.

În diagnosticul borreliozei Lyme, sunt utilizate în primul rând metode serologice precum ELISA, dar în unele situații clinice sunt utile testele genetice care utilizează metoda PCR.

Cu cât timpul de infecție este mai lung, cu atât este mai puțin probabil să detecteze ADN-ul bacterian. Prin urmare, în unele cazuri, înainte de efectuarea testului PCR, bacteriile sunt cultivate pe medii speciale timp de 1-2 săptămâni și apoi se efectuează testul.

Această abordare este utilizată în caz de suspiciune de boală Lyme și de lichid cefalorahidian recoltat. În faza târzie a infecției, este mai potrivit să se efectueze un test ELISA.

Metoda PCR nu ar trebui utilizată în diagnosticul de rutină al borreliozei Lyme din cauza lipsei de standardizare cu privire la apariția soiurilor Borrelia burgdorferi în Polonia.

Cu toate acestea, în cazul dificultăților de diagnostic (în special în stadiul incipient al bolii), rezultatul testului PCR ajută la procesul de diagnosticare.

Un rezultat pozitiv al testului înseamnă că prezența ADN-ului Borrelia burgdorferi și a soiurilor sale a fost detectată în materialul testat, dar nu explică dacă are loc o infecție activă în organism. Pe de altă parte, un rezultat negativ nu exclude prezența bacteriilor în organism.

Unele laboratoare oferă testarea prezenței ADN Borrelia în căpușă. Cu toate acestea, rezultatul unei astfel de examinări nu este baza diagnosticării bolii Lyme la o persoană mușcată.

Articol recomandat:

Test ELISA - ce detectează? Cum se citesc rezultatele? Prețul testului

PCR - rezultate. Pot fi fals pozitivi?

PCR este o metodă ultra-sensibilă și, în același timp, foarte sensibilă la contaminare. Prin urmare, este foarte important în testele bazate pe PCR să selectați un control intern adecvat pentru a exclude pozitivele false.

Cheia este, de asemenea, colectarea corectă a materialului pentru testare, precum și experiența și fiabilitatea diagnosticului care efectuează testul.

PCR - rezultate. Pot fi fals negative

Ca în orice test de laborator, și în metoda PCR, pot apărea rezultate fals negative. Aici este crucial să colectăm sânge pentru un anticoagulant adecvat, deoarece unele dintre ele, cum ar fi heparina, pot inhiba reacția PCR.

De asemenea, colectarea materialului după începerea tratamentului cu antibiotice poate determina o scădere a eficienței reacției PCR și o probabilitate mai mare de rezultate fals negative.

De asemenea, trebuie amintit faptul că bacteriile Borrelia trăiesc o perioadă foarte scurtă de timp în sânge și în fluidele corpului, deoarece datorită receptorilor speciali pătrund foarte repede în locurile „greu accesibile” din corp.

Prin urmare, spre deosebire de diagnosticul altor microorganisme, numărul de spirochete Borrelia din materialul biologic este mic, uneori chiar la limita de detectare a metodei PCR. Acest lucru poate provoca, de asemenea, un negativ fals.

Articol recomandat:

Test de transformare a limfocitelor (LTT)

Literatură

1. Dunaj J. și colab. Importanța metodei PCR în diagnosticul borreliozei Lyme. Naviga Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
2. Diagnosticul de laborator al bolilor transmisibile de căpușe
3. Ružić-Sabljić E. și Cerar T. Progres în diagnosticul molecular al bolii Lyme. Expert Rev Mol Diagn. 2017 ianuarie; 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. et al. Principiile și aplicațiile reacției în lanț a polimerazei în domeniile de diagnostic medical: o revizuire. Braz J Microbiol. 2009 ianuarie-mar; 40 (1): 1-11.

Despre autor

Karolina Karabin, MD, dr., Biolog molecular, diagnostic de laborator, Cambridge Diagnostics Polska Format ca biolog cu specializare în microbiologie și diagnostic de laborator cu peste 10 ani de experiență în activitatea de laborator. Absolvent al Școlii de Medicină Moleculară și membru al Societății Poloneze de Genetică Umană.Sef de granturi de cercetare la Laboratorul de Diagnostic Molecular de la Departamentul de Hematologie, Oncologie și Boli Interne ale Universității Medicale din Varșovia. Ea a susținut titlul de doctor în științe medicale în domeniul biologiei medicale la Facultatea I de Medicină a Universității Medicale din Varșovia. Autor al multor lucrări științifice și științifice populare în domeniul diagnosticului de laborator, al biologiei moleculare și al nutriției. În fiecare zi, în calitate de specialist în domeniul diagnosticului de laborator, el conduce departamentul de fond de la Cambridge Diagnostics Polska și cooperează cu o echipă de nutriționiști la Clinica Dietetică CD. Își împărtășește cunoștințele sale practice cu privire la diagnosticul și terapia dietetică a bolilor cu specialiști la conferințe, traininguri, reviste și site-uri web. Este interesată în special de influența stilului de viață modern asupra proceselor moleculare din organism.